Técnica
¿Cómo hacer un antibiograma?
1. Selección de colonias
Seleccionar varias colonias de la bacteria que esté analizando (3 a 5 colonias), con el fin de aumentar la probabilidad de detectar resistencia.
2. Preparación y estandarización del inóculo.
Preparar a partir de un cultivo puro, de 18-24 horas de incubación, una suspensión directa de colonias, y comparar la turbidez de la suspensión con el patrón de turbidez 0,5 de la escala Mc Farland (lo que corresponde a aproximadamente 1,5 x 10^8 UFC/mL).
Las suspensiones se realizan en suero fisiológico o caldo Mueller-Hinton, las cuales deben ser homogenizadas en un agitador, previo al ajuste de turbidez.
La medición debería ser realizada a través de un turbidímetro, en caso contrario comparando directamente (visualmente) la suspensión preparada con el control 0.5 de Mc Farland, bajo luz transmitida a través de la tarjeta Wickerham. Una vez ajustada la suspensiones, esta debe ser usada dentro de los 15 minutos siguientes.
Precauciones
Una mayor densidad del inoculo implica una menor inhibición, y por tanto una falsa resistencia.
Una menor densidad del inoculo implica una mayor inhibición, y por tanto una falsa sensibilidad
3. Proceso para la inoculación de la placa.
Antes de realizar la inoculación, se
debe retirar del congelador o refrigerador los discos para permitir que estos
se adapten a la temperatura ambiente. Esto debe realizarse una hora antes de
usar, para minimizar la condensación y reducir la posibilidad de que la humedad
afecte la concentración de los agentes antimicrobianos contenidos en los
discos.
Remover el exceso de caldo, presionando la tórula sobre las paredes del tubo y proceder a la inoculación de las placas.
Con la tórula inocule la superficie comenzando en la parte superior de la placa. Cubra toda la placa frotando de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la placa en tres direcciones y repita el procedimiento de siembra al menos 3 veces. Esto garantizará que el inóculo sea distribuido homogéneamente.
4. Aplicación de los discos de antimicrobiano.
Coloque los discos con los agentes antimicrobianos dentro de los 15 minutos siguientes a la inoculación de la placa MHA. Los discos pueden ser depositados uno a uno con ayuda de pinzas estériles o con un dispensador de discos multicanal.
Se pueden aplicar un máximo 12 discos en una placa de 150 mm de diámetro o hasta 6 discos en una placa de 100 mm. Los discos deben ser colocados a una distancia no menor de 24 mm de centro a centro.
En el caso de Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, S. pneumoniae y Streptococcus beta hemolíticos, se indica aplicar un máximo 9 discos en una placa de 150 mm de diámetro o hasta 4 discos en una placa de 100 mm.
Precauciones y recomendaciones de los sensidiscos
Presionar cada disco firmemente para asegurar el contacto completo con la superficie de agar.
Almacenar a - 20ºC en envases herméticos e impermeables con desecador. Seguir recomendaciones del fabricante.
Nunca reubique un disco una vez que éste ha tomado contacto con la superficie del agar.
Se recomienda situar las cajas alejadas de las paredes del congelador
donde se encuentra la acumulación de hielo.
No almacene discos en un congelador libre de escarcha (nonfrost)
No usar discos después de su fecha de vencimiento
Use productos validados para diagnóstico in vitro, como los aprobados por la FDA o CE-IVD.
Use discos con el contenido de antimicrobiano especificado en los
estándares de CLSI
5. Incubación de la placa de agar
Todo aislamiento bacteriano requiere seguir ciertas recomendaciones, desde atmósfera y tiempo de incubación, medio ideal para estudio de susceptibilidad.
Una vez sembrado el inóculo y depositado los discos, coloque la tapa, invierta las placas e incúbelas, según recomendaciones CLSI vigente (CLSI 2020).
Para mayor información visite: CLSI M100-ED30 - Estándares de rendimiento 2020 para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, 30a edición.
6. Medición de las zonas de inhibición
Después de retirar la placa de la incubadora, se debe examinar detenidamente la placa para verificar que el crecimiento sea uniforme y confluente, de tal modo que permita obtener halos de inhibición bacteriana simétricos y definidos. Estos deben ser medidos completamente, incluyendo el diámetro del disco.
6.1 Medición de las zonas de inhibición usando luz reflejada.
Luz reflejada es la luz que proviene desde arriba con una lámpara sobre un fondo negro. Se deben medir halos definidos con una regla o un pie de metro.
Al realizar lectura en medios como Mueller-Hinton Sangre cordero 5%, se sugiere retirar la tapa y medir los halos desde la parte superior.
6.2 Medición de las zonas de inhibición usando luz transmitida
La lectura debe realizarse utilizando luz transmitida, luz que llega desde la parte
posterior de la placa, es decir, la placa se mantiene hacia la luz (lámpara) y
se debe considerar el desarrollo al interior del halo el cual puede pasar
desapercibido si se utiliza luz reflejada.
Se utiliza en:
Enterococcus spp. con vancomicina
Staphilococcus spp. con linezolid
Las zonas de inhibición de linezolid y tedizolid con S. aureus ATCC ® 25923
Staphilococcus aureus con mupirocina
7. Interpretación de los resultados
Cada halo alrededor del disco debe ser leído cuidadosamente, midiendo el diámetro en milímetros con una regla o pie de metro. El resultado de esta medición se interpreta basándose en los puntos de corte tabulados en las tablas CLSI vigente las cuales contienen los criterios Resistente, Intermedio, Sensible o No Sensible, según corresponda para cada bacteria en estudio. Actualmente se ha incorporado la categoría de Susceptibilidad dosis dependiente (SDD) en el caso de Cefepime, solamente para Enterobacterias.
Ejemplo de puntos de corte, con su categoría interpretativa.
Sensible (S): Una categoría definida por un punto de corte que implica que los aislamientos con un diámetro de zona por encima del punto de corte susceptible se inhiben por las concentraciones usualmente alcanzadas del agente antimicrobiano, empleando la dosis recomendada para tratar el sitio de infección, lo que resulta en probable eficacia clínica.
Susceptibilidad dosis dependiente (SDD): Una categoría definida por un punto de corte que implica que la susceptibilidad de un aislado depende del régimen de dosificación que se utiliza en el paciente. Para lograr niveles que probablemente sean clínicamente efectivos contra los aislamientos, es necesario usar un régimen de dosificación (es decir, dosis más altas, dosis más frecuentes, o ambas) que resulte en una exposición al fármaco más alta que la lograda con la dosis que se usó para establecer el punto de corte susceptible.
Intermedio (I): Una categoría definida por un punto de corte que incluye aislamientos con diámetros de zona dentro del rango intermedio, que se acercan a niveles de sangre y tejidos generalmente alcanzables y/o cuyas tasas de respuesta pueden ser más bajas que para aislamientos susceptibles.
No susceptible (NS) : Una categoría utilizada para aislamientos para los que solo se designa un punto de corte susceptible debido a la ausencia o la rara aparición de cepas resistentes. Los aislamientos para los cuales los diámetros de zona de inhibición están por debajo del valor indicado como punto de corte susceptible deben informarse como no susceptibles.
Resistente (R): Una categoría definida por un punto de corte que implica que los aislamientos con un diámetro de zona en o por debajo del punto de resistencia no están inhibidos por las concentraciones usualmente alcanzables del agente antimicrobiano en programas de dosificación normales, por tanto, la eficacia clínica no se ha demostrado de manera confiable en los estudios de tratamiento.